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本试剂盒使用的一种专属型“蓝色荧光”染料是疏水性化合物，很容易穿透完整活细胞，进入活细胞后荧光性增强，通过细胞内酯酶水解弱荧光性底物，产生具有强烈绿色荧光的亲水性产物，并且可以在保持在细胞质中。通过本试剂盒使非荧光底物生成的绿色荧光基团在吸收波长490nm发射波长520nm具有荧光特性，在波长488nm处氩离子激光器活跃，520nm发射强的绿色荧光。本试剂盒提供微量荧光板试验所有必须成分和最佳的细胞标记方案。本试剂盒也可用于配备FITC滤光片设备的荧光显微镜，本试剂盒是微量荧光板试验和活细胞微量监控的一种有效标记工具。它在许多研究中非常有用，包括细胞粘附性、趋化作用、药物抗性、细胞活性、细胞凋亡和细胞毒性研究。本试剂盒适用于增殖细胞和非增殖原代细胞。

组分	规格
组分A：CytoCalcein Green	5支
组分B：DMSO	200μL
组分C：Assay Buffer	50mL

保存：-20℃，避光


使用前，请将该试剂盒的所有组分在室温下解冻

• 在侧壁暗色底部透亮的多孔细胞板中，细胞计数，每孔铺100～10000个细胞，每个细胞孔中加入待测的化合物，在细胞培养箱中，孵育所需要的时间（比如24，48，或96个小时）。对于空白对照孔（不含细胞的培养基），加入等量的待测物缓冲液。对于96孔，建议细胞培养板每孔总体积为100μL，384细胞微量板，建议细胞培养板每孔总体积为25μL。
  
  • 细胞培养板中每株细胞的最佳浓度，是基于实验目的检测细胞增殖或是检测细胞毒性的不同，对于细胞增殖检测，每孔细胞浓度要尽量低，对于细胞毒性检测，每孔细胞初始浓度要尽量高。
• 加20μL DMSO (组分B)至含CytoCalcein Green (组分A)小瓶里，充分混匀。
  
  • 20μL体积的CytoCalcein Green染料储备液量足够一个板使用，未用的CytoCalcein Green染料储存液储存于密闭的管子里，低于-20℃冷冻，避光，可保存一个月，期间应避免反复冻融。
• 把总体积20μL的CytoCalcein Green染料储备液全部添加到10mL Assay Buffer(组分C)中，充分混匀，此工作液室温下可稳定保存至少2小时。
  
  • 假如处理的是CHO细胞，由于其富含阴离子转运蛋白，随着时间的变化，能导致染料荧光性变弱。所以向工作溶液里加入羧苯磺丙胺溶液，配置成终工作浓度1～2.5mM，羧苯磺丙胺溶液分装并置于-20℃保存。
• 用所需要的药物处理细胞（步骤1）
  
  • 添加化合物之前没必要洗涤细胞，然而，如果被测物是血清敏感性的，在添加药品之前，必须去除培养基中血清成分，96孔板中每孔加入100μL，384微孔板每孔加入25μL含20mM Hepes的Hanks缓冲液或其他缓冲液，最终，保证细胞生长在无血清的培养基中。
• 往96孔板中每孔加入100μL，384微孔板每孔加入25μL染色工作液。
  
• 室温或37℃，避光孵育一个小时，（孵育时间可以从15分钟到过夜，我们得到最佳的孵育时间是少于4个小时）
  
  • 最佳孵育时间是根据细胞类型和细胞浓度确定，每个实验要优化下孵育时间。
    
  • 加完染色工作液后禁止洗涤细胞。
    
  • 对于未贴壁细胞，孵育后要800rpm，离心2分钟。
• 测定和计算每孔的荧光度比值Ex/Em = 490/525nm

背景值是加入药物处理细胞的吸光值减去无细胞空白孔值相减所得，空白孔背景值随着细胞板材质和培养基的不同而不同。

图1．CHO-K1细胞数目的响应值就是用Cell Viability Test Kit所测，使用柯仕达厂家的黑色侧壁透明底部的96孔细胞培养板，每孔总体积100μL，设置每孔0到5000个细胞梯度并加入测试试剂，过夜培养。加入CytoCalcein Green染色工作液每孔100μL，37℃，孵育1小时。光吸收酶标仪分别测算出490nm和525nm处的吸光值比值，如图所示，细胞数目和其荧光强度是线性关系（相对系数=1），最低检测限，每孔30个细胞（n=6）。
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